A jednak się kręci, czyli dowód, że czaga działa!

Już jakiś czas temu nieoceniony pan Jacek Gdowski (bienergoterapueta prowadzący praktykę wg. metody Zdenko Domancica, e mail: tobioenergoterapia@gmail.com). przysłał nam wyszperaną gdzieś w sieci publikację naukową dotyczącą badań prowadzonych nad przeciwnowotworowymi właściwościami guza brzozy. Był to efekt rozmowy telefonicznej, jaką przeprowadziliśmy po opublikowaniu na naszym blogu wpisu o czadze oraz dyskusji nad szeroko pojętą jakością doniesień na temat tego surowca leczniczego dostępnych w języku polskim. Zgodziliśmy się wówczas, że największą krzywdą, jaką można wyrządzić chorym, jest brak rzetelnej informacji o czadze oraz skupianie się, w czym przodują pisane na zamówienie pseudo-artykuliki oparte na taniej sensacji, na zasłyszanych, niepotwierdzonych, za to bardzo medialnych incydentach. Np. jak puszczona w eter wiadomość o cierpiącej na raka osobie, która w terminalnym stadium choroby piła duże ilości wyciągu z guza brzozy, po czym zmarła nie z powodu nowotworu, lecz na skutek uszkodzenia wątroby (przy jednoczesnym przemilczeniu faktu, że wcześniej pacjent wielokrotnie poddawany był niezwykle toksycznej chemioterapii, która już w jednorazowej dawce potrafi mocno upośledzić działanie tego wrażliwego organu). Tymczasem polskojęzyczny Internet milczy na temat kolejnych analiz prowadzonych w zaciszach laboratoriów biotechnologicznych, których wyniki zdają się potwierdzać, że guz brzozy nie szkodzi, a wręcz odwrotnie - wymiernie pomaga chorym na nowotwory (a przynajmniej - niektóre ich typy).

Aby to zmienić, postanowiłam wspomnianą publikację przetłumaczyć na język polski. Oryginał znajduje się pod tym linkiem, natomiast ze względu na wysoki stopień trudności tekstu polskie tłumaczenie opatrzyłam stosownymi wyjaśnieniami. Mam nadzieję, że uczynią one całość dużo bardziej zrozumiałą nawet dla osób, które swoją przygodę z chemią i biologią zakończyły wiele lat temu. Moje przypisy, dla odróżnienia od pierwotnej treści opisu badań, wyróżniam innym kolorem i krojem czcionki (kursywa). Oczywiście będę używać pewnych uproszczeń, ale pomogą one w zrozumieniu mechanizmu działania guza brzozy, tym razem już potwierdzonego naukowo.

Guz brzozy

Zanim jednak przejdę do właściwego tekstu, chciałabym w skrócie wyjaśnić sobie kilka podstawowych pojęć, które pomogą zrozumieć podstawy prowadzonych testów naukowych. Przede wszystkim należy sobie uświadomić, czym jest nowotwór: otóż jest to choroba, która polega na niekontrolowanym, niepohamowanym rozroście komórek, które nigdy nie przekształcają się w tkankę (czyli nie są zdolne podjąć prawidłowych funkcji właściwych dla danego narządu), a jednocześnie nie słuchają rozkazów wysyłanych przez organizm (np. sygnałów, że mają przestać się namnażać). Każda zdrowa komórka może potencjalnie stać się zarzewiem nowotworu. Dzieje się tak, ponieważ w każdej komórce występują tzw. geny onkogenne. Geny onkogenne nie powodują choroby tak długo, aż pod wpływem mutacji nie zmienią swojego sposobu działania (ekspresji), przy czym takie mutacje mogą, lecz nie muszą wystąpić u każdego człowieka. Niektórzy są mniej, inni bardziej podatni na mutacje, co tłumaczy, dlaczego niektórzy zapadają w ciągu życia nawet na dwa, trzy nowotwory, podczas gdy inni nigdy nie cierpią na dolegliwości onkologiczne..    

Komórki, z których zbudowane jest nasze ciało, ulegają nieustannym podziałom. Dzięki istnieniu mechanizmu namnażania komórek możemy powstać, urodzić się, rosnąć, trwać czy zdrowieć. Podczas każdego takiego podziału materiał DNA ulega skopiowaniu, czyli replikacji. Proces prowadzący do podziału komórkowego to tzw. CYKL KOMÓRKOWY. Dzieli się na kilka podstawowych faz:

G1 - następuje aktywacja enzymów niezbędnych do skutecznego podziału komórki;

S - dochodzi do skopiowania DNA;

G2 - wzrasta aktywność białek niezbędnych do skutecznego podziału komórki

M - następuje podział komórki

Po czym zdrowa komórka znów przechodzi do fazy G1, a cały proces się powtarza. Naukowcy wyróżniają jednak jeszcze jedną fazę cyklu, czyli

G0 - stan spoczynku komórki, dotyczy komórek starzejących się i poprzedza ich śmierć.

Tak powstaje rak

Podczas wielokrotnych replikacji DNA komórki często ulega uszkodzeniu, np. mutacji lub przerwaniu. Natura przewidziała takie sytuacje i wyposażyła komórki w mechanizm tzw. apoptozy, czyli zaplanowanej, samobójczej śmierci. Żeby nie powielać błędów w DNA, po wykryciu uszkodzenia w łańcuchu genów większość komórek zamiast nadal się rozmnażać, przechodzi do fazy G0 i po prostu umiera (ulega samozniszczeniu). Wraz z nimi umierają wadliwe mutacje, czyli potencjalny nowotwór, a człowiek pozostaje zdrowy.

Zdarza się jednak, że apoptoza nie zachodzi, a zmutowana komórka staje się „nieśmiertelna”. Zachowuje jednak zdolność do rozmnażania się – zamiast po fazie cyklu G0 umrzeć i zostać usuniętą z organizmu, przechodzi do fazy G1 i następnie bezustannie produkuje swoje wadliwe kopie, równie nieśmiertelne, jak ona sama. One również się namnażają, tworząc coraz większą kolonię zmutowanych komórek, w których DNA dochodzi do dalszych, pogłębiających się uszkodzeń. Tak powstaje nowotwór nazywany powszechnie „złośliwym”, czyli taki, który bezustannie i w niekontrolowany sposób rozrasta się w organizmie, a jedynym sposobem jego opanowania jest doszczętne wycięcie wszystkich zlokalizowanych ognisk choroby, ewentualnie jego wytrucie za pomocą chemii, która przy okazji zabija lub uszkadza całą masę zdrowych i prawidłowo działających komórek ciała. 

Schemat apoptozy - zniszczona
komórka jest usuwana z
organizmu przez makrofagi,
czyli rodzaj białych
ciałek krwi

Biologów przez wiele lat fascynowało pytanie: co kieruje zachowaniem komórki? Skąd każda z nich wie, kiedy powinna się rozmnożyć, a kiedy umrzeć? Pod wpływem jakich bodźców podejmuje ona konkretne działania? Czy takim mechanizmem można sterować? Czy można zmusić komórkę do samobójstwa? Znalezienie odpowiedzi na te pytania zrewolucjonizowałoby medycynę, bowiem poznanie sposobu kierowania cyklem życia komórki i procesów zachodzących na poziomie genów to klucz do nieśmiertelności.

Prowadzone wiele lat badania pozwoliły uchylić rąbka tajemnicy przynależnej bogom. Odkryto, że za mechanizmami kierującymi życiem, rozmnażaniem i śmiercią komórek stoją substancje nazywane cyklinami (białka), kinazami cyklinozależnymi (enzymy CDKs) oraz inhibitorami cyklinozależnymi (białka CDKi). Jest ich całe mnóstwo różnych rodzajów, ale póki krążą w komórce w sposób wolny – nic się nie dzieje, są nieaktywne. Dopiero gdy połączą się w kompleks tworzony przez parę dwóch, ściśle określonych rodzajów cykliny i kinazy, zaczyna się coś dziać. Komórka podejmuje konkretne działanie, np. zaczyna przygotowywać się do podziału albo do śmierci.

Każdym typem zachowania komórki kieruje inna para cyklina-kinaza, które aktywują dane białka obecne w komórce, a te z kolei oddziałują w geny zawarte w DNA. Ponieważ jednak zdarzają się sytuacje, gdy dany proces należy przerwać, natura stworzyła również inhibitory, czyli substancje, które „wyhamowują” dane zachowanie komórki, przechwytując sygnał wysyłany do niej przez parę cyklina-kinaza. Cały mechanizm jest oczywiście dużo bardziej złożony (na tyle, że wyjaśnienie poszczególnych etapów czy faz honoruje się nagrodami Nobla z dziedziny medycyny), ale przecież nie bawimy się tutaj w naukowców – chodzi o to, żeby zrozumieć ogólne zasady rządzące całym procesem. Generalnie, w odniesieniu do onkologii procesy zachodzące na poziome komórkowym, uważa się współcześnie za kluczowe dla opracowania nowych, skuteczniejszych metod leczenia raka. Główna idea zakłada, że nowotwór złośliwy nie musi być nieśmiertelny – jeśli odpowiednio pobudzi się mechanizmy prowadzące do apoptozy komórek, będzie można nie tylko zatrzymać jego rozwój, lecz również w nieinwazyjny dla organizmu sposób zaleczyć ogniska choroby.

Co do tego wszystkiego ma guz brzozy? Okazuje się, że bardzo dużo. Poniżej zamieszczam tłumaczenie rzeczonego artykułu:

(…)

Streszczenie

CEL: Badanie wpływu wyciągu wodnego z błyskoporka podkorowego (Inonotus obliquus) na namnażanie i apoptozę kultury komórek ludzkiego raka wątrobokomórkowego HepG2 i Hep3B.

METODA: Cytotoksyczność ekstraktu z czagi monitorowano za pomocą metody MTT (bromek  3–(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy). W celu wyjaśnienia mechanizmu działania wyciągu z guza brzozy przeprowadzono badania morfologiczne, analizę cystometrii przepływowej i metodę western blot.

WYNIK: Komórki HepG2 były bardziej wrażliwe na wyciąg z czagi niż komórki Hep3B, czego dowiodła ich zauważalnie obniżona aktywność biologiczna. Ekstrakt z guza brzozy, w zależności od dawki, hamował rozrost komórek nowotworowych poprzez zatrzymanie fazy cyklu komórkowego G0/G1, a następnie inicjował mechanizm apoptozy. Ponadto zatrzymanie cyklu komórkowego G0/G1 ściśle wiązało się z zahamowaniem ekspresji białek p53, pRb, cyklin D1, D2, E oraz kinaz zależnych od cyklin (Cdk) 2, Cdk4 i Cdk6.

PODSUMOWANIE: Wyciąg z guza brzozy może stanowić alternatywny środek leczniczy jako potencjalny środek przeciwnowotworowy w przypadku leczenia raka wątroby.

(…)

WSTĘP

Napar z guza brzozy

Błyskoporek podkorowy (Inonotus obliquus) to rodzaj grzybów z rodziny szczeciniakowatych zaliczanych do gromady grzybów podstawkowych wywołujących białą zgniliznę drewna.  Błyskoporki porastają pnie brzóz w strefie klimatów chłodnych. Od XVI wieku na terenie Rosji i zachodniej Syberii błyskoporek wykorzystywany był jako ludowy środek leczniczy. Współcześnie dowiedziono, że wiele związków polifenolowych pozyskanych ze sklerot grzybów z rodzaju inonotus, między innymi triterpenoidy, steroidy i nadtlenki ergosteroli, wykazuje zróżnicowaną aktywność biologiczną, w tym posiada właściwości antybakteryjne, osłaniające wątrobę oraz przeciwnowotworowe. Jednak mimo rosnącego spożycia surowca mechanizmy molekularne jego działania antyrakowego nie zostały dobrze udokumentowane.

Naturalne produkty, w tym tysiące związków obecnych w owocach, warzywach, grzybach i ziołach wykorzystywano jako źródło substancji leczniczych na różne rodzaje raka lub jako suplementy zdrowej żywności dla ludzi. W szczególności grzyby lecznicze z rodzajów Auricularia, Flammulina, Pleurotus, i Trametes uznano za obiecujące ze względu na dowiedzione właściwości przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe, przeciwpasożytnicze oraz regulujące działanie systemu immunologicznego[4]. Donoszono, że grzyby lecznicze działały cytotoksycznie na komórki rakowe przez indukcję apoptozy połączonej ze zmianą przebiegu cyklu komórkowego [10].

Działanie cytotoksyczne to inaczej działanie trujące lub w inny sposób szkodliwe dla danej komórki, powodujące jej uszkodzenie lub śmierć. Indukcja apoptozy to z kolei uruchomienie mechanizmu samozniszczenia komórki.

W przypadku zdrowych komórek ich proliferacja (rozmnażanie i rozprzestrzenianie) i śmierć związane są ze zjawiskiem homeostazy (równowagi biologicznej); homeostaza często jednak ulega zakłóceniu w przypadku komórek rakowych, które zaczynają rozrastać się w sposób niekontrolowany. Właściwości przeciwnowotworowe mogą wynikać ze zmiany mechanizmów biochemicznych, w tym zahamowania rozrostu komórek, zatrzymania cyklu komórkowego w poszczególnych fazach, przyspieszenia apoptozy oraz regulacji szlaków komunikacji międzykomórkowej, czyli zaburzenia ekspresji kluczowych enzymów. Kinazy zależne od cyklin (Cdks), inhibitory CDK (CDKIs), oraz cykliny stanowią ważne czynniki regulujące postęp cyklu komórkowego.  Co więcej, każda faza cyklu komórkowego  podlega regulacji przez odmienne Cdks połączone z odpowiadającymi im indywidualnymi jednostkami regulatorowymi, czyli cyklinami.  Fazy cyklu komórkowego G0/G1 kontrolowane są przez kompleksy tworzone przez Cdk4/Cdk6 i cykliny D, przejście z fazy G1 do wczesnej fazy S - przez kompleksy Cdk2 i cykliny E; przebieg fazy S przez kompleks Cdk2 i cykliny A; natomiast faza G2/M przez kompleks kinazy Cdc2 oraz cyklin A/B[12]. Wzrost ekspresji kinaz Cdks i cyklin połączony z podwyższeniem aktywności CDK obserwuje się w większości komórek rakowych, co może wiązać się procesem ich niekontrolowanego i nieopanowanego namnażania [13]. Współcześnie wiele badań dowiodło, że zahamowanie aktywności CDK prowadzące do zatrzymania postępu cyklu komórkowego stanowi najbardziej obiecującą strategię prowadzącą do odkrycia i produkcji nowych leków przeciwnowotworowych. W związku z powyższym zahamowanie postępu cyklu komórkowego i indukcja mechanizmu apoptozy to najważniejsze wskaźniki właściwości antyrakowych. [14].

W niniejszej próbie badaliśmy właściwości przeciwnowotworowe wyciągu z guza brzozy oraz mechanizmy molekularne zachodzące w żywych komórkach raka wątroby HepG2 wstrzymywane przez ekstrakt z błyskoporka.

MATERIAŁY I METODY

Przygotowanie wyciągu wodnego z błyskoporka

Wodny wyciąg z byskoporka podkorowego przygotowano w następujący sposób. W badaniu wykorzystano błyskoporek podkorowy, Inonotus obliquus, zebrany w Rosji. Grzyb poddano ekstrakcji w optymalnych warunkach przygotowania wyciągu wodnego. Pokruszony, wysuszony surowiec (1,00 kg) przez 4 godziny gotowano w temperaturze 100 st. C., następnie schłodzono do temperatury pokojowej i przefiltrowano. Wyciąg odparowano do sucha w próżniowej wyparce rotacyjnej i wymrożono przed zmieleniem na proszek (250 g). Roztwór macierzysty ekstraktu z czagi przygotowano rozpuszczając sproszkowany guz brzozy w wodzie destylowanej (50 mg/Ml), a stężenia doświadczalne rozpuszczano w pożywce podstawowej.

Kultura komórkowa i odczynniki

Kultury komórkowe HepG2 i Hep3B ludzkiego raka wątroby, jak również kulturę zdrowych komórek Chang wątroby otrzymano z American Type Culture Collection (Rockville, MD) i utrzymywano w pożywce MEM (Gibco, Grand Island, NY) na płodowej surowicy bydlęcej nie wymagającej inaktywowania ciepłem (FBS, Gibco), penicylinie (100 U/mL) i streptomycynie (100 μg/mL) poniżej 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze w temp. 37℃. Jodek propidyny (PI), Triton X-100 i rybonukleazę-A zakupiono od Sigma (St. Louis, MO, USA). Antyciała pochodziły od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Analiza aktywności biologicznej komórek

Aktywność biologiczną komórek oceniono na podstawie analizy barwnika MTT (bromek 3–(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, formazan błękitu triazolowego). W skrócie, komórki wysiano na płytce testowej 48-dołkowej przy zachowaniu gęstości 5 × 104 komórek/dołek i pozostawiono w temperaturze 37℃ na 12 godzin. Następnie dodano wyciąg z guza brzozy o zróżnicowanym stężeniu i pozostawiono do hodowli na 48 godzin. Po upływie tego czasu do 1 mL zawiesiny komórkowej na 4 godz. wprowadzono barwnik MTT (0.5 mg). Zdolność komórek do wytwarzania kryształów formazanu określono za pomocą czytnika mikropłytek (Titertek Multiskan, Flow Laboratories, North Ryde, Austria) po rozpuszczeniu kryształów w odczynniku DMSO. Wolny dołek wykorzystano do próby ślepej. Cytotoksyczność wyrażono jako względny procent absorbancji (chłonności) mierzonej dla komórek kontrolnych i komórek poddanych działaniu ekstraktu. Zmiany morfologiczne powstałe na skutek działania wyciągu z guza brzozy oceniono za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym (Olympus, Japan).

Prościej: hodowano komórki rakowe na płytkach laboratoryjnych. Następnie do części komórek dodawano wyciąg z guza brzozy o określonym stężeniu. Po dwóch dniach dokładano żółty barwnik, który jest "trawiony" przez żywe komórki, a w efekcie tego trawienia powstają kryształy o barwie purpury. Jeśli komórki rakowe są żywe, a w ich wnętrzu zachodzą procesy metaboliczne, zmieniają swój kolor na fioletowy. Jeśli są martwe - próbka pozostaje jasna. Ocena uzyskanego odcienia purpury pozwala określić, jaki procent komórek rakowych wciąż pozostaje żywa, a jaka część zginęła.

Analiza cyklu komórkowego na poziomie DNA

Dla określenia zawartości komórkowego DNA wykorzystano metodę cytometrii przepływowej. W skrócie: 5 × 105 komórek wysiano na płytkach sześciodołkowych i pozostawiono na noc. Komórki wstawiono na działanie wyciągu z guza brzozy o zróżnicowanym stężeniu (250, 500, 750, 1000 μg/mL) przez 48 godzin. Po tym czasie komórki zostały zebrane za pomocą trypsyny, przemyte schłodzonym PBS i wybarwione za pomocą jodku propidyny (PI) w roztworze (50 μg/mL PI, 100 μg/mL RNase i 0.1% Triton X-100 w PBS). Analizie poddano histogramy DNA wybarwionych komórek i za pomocą metody cytometrii przepływowej określono ilość komórek pozostających w poszczególnych fazach cyklu (FACSCalibur, BD Bioscience). Dane dotyczące 10.000 komórek na próbkę zostały zebrane i przeanalizowane za pomocą oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson). Dla określenia ilości komórek pozostających w danej fazie cyklu G1, S, oraz G2/M, ustawienia 2 mol/L i 4 mol/L pików zawartości DNA dla każdego badania uzyskano wykorzystując komórki zahamowane w fazie cyklu  G0/G1 (2 mol/L) jako próbkę kontrolną stanowiącą materiał porównawczy we wszystkich testach.

Western blot

Ekstrakty cytosolowe białek otrzymano stosując poprzednio opisane metody. W skrócie, komórki zostały zebrane przez odwirowanie 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 st.C i zmycie schłodzonym PBS. Osad komórkowy został następnie zawieszony w 500 μL bufora lizującego (20 mmol/L HEPES- KOH, pH 7.5, 250 mmol/L sacharozy, 70 mmol/L mannitol,u 1.5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L KCl, 10 μg/mL leupeptyn, i 10 µmol/L digitoniny). Po trwającej 10 min inkubacji w temp. 25 st.C, próbka została odwirowana 14 000 × g przez 15 min, a supernatant zawierający białka cytozolowe przechowywano w temp. -70 st.C do momentu analizy metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Wyciąg proteinowy poddany standardowej  analizie SDS-PAGE, przeniesiono na błony z polifluorku winylidenu (Millipored) i oznakowano odpowiednimi antyciałami jak podano w poszczególnych opisach rysunków. Przeciwciała pierwszorzędowe oznakowano przy wykorzystaniu peroksydozy chrzanowej znaczonej przeciwciałem drugorzędowym, zaś ciąg reakcji uwidoczniono za pomocą zestawu wzmocnionej chemiluminescencji. Analizę Western blot przeprowadzono z wykorzystaniem przeciwciał dla białek pRb, p53, p27, cyklin E, D2, D1, Cdk2, 4, 6, prokaspazy 3, i β-aktyny (Santa Cruz Biotechnology) w optymalnym rozcieńczeniu. β-aktyna jako wewnętrzny czynnik kontrolny dla potwierdzenia pobrania równej ilości protein.

Analiza statystyczna

Przedstawione dane stanowią wynik co najmniej trzech badań i zostały przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe. Ocenę statystyczną wyników przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA Wyniki uznano za istotne dla wartości z przedziału P < 0.05, P < 0.01.

WYNIKI

Działanie cytotoksyczne wyciągu z guza brzozy na komórki HepG2

Aby ocenić wynik działania ekstraktu z guza brzozy na proliferację oraz morfologię komórek raka wątrobowokomórkowego, na początek określono wpływ wyciągu z czagi na zahamowanie namnażania się komórek rakowych HepG2 i Hep3B, jak również na unieśmiertelnione, zdrowe komórki Chang ludzkiej wątroby.  Komórki wystawiono na działanie zróżnicowanych dawek wyciągu z czagi na 48 h, zaś ich aktywność biologiczną oceniono metodą MTT. Jak pokazuje rys. 1A, stężenie ekstraktu z guza brzozy miało wpływ na krzywą żywotności komórek HepG2 i Hep3B, przy czym komórki HepG2 okazały się bardziej wrażliwe na działanie wyciągu niż komórki hep3B (rys. 1A). Po upływie 48 h od momentu wystawienia komórek HepG2na działanie 750 μg/mL ekstraktu z guza brzozy, aktywność biologiczna tych komórek uległa redukcji o 60% (P<0,01) w porównaniu z próbką kontrolną. Po upływie 48 h od momentu ekspozycji komórek na działanie wyciągu z guza brzozy o stężeniu 1000 μg/mL, aktywność biologiczna HepG2 wyniosła 36%, a komórek Hep3B - odpowiednio 67%. Z kolei zdrowe komórki Chang wątroby nie wykazały znaczącej wrażliwości na 48-godzinne działanie wyciągu z czagi (1000 μg/mL) (Rys. 1A). Podsumowując: uzyskane wyniki wskazały, że wyciąg z czagi podwyższał śmiertelność komórek rakowych HepG2 i Hep3B w efekcie apopotozy. 

Następnie zbadaliśmy, czy cytotoksyczność wyciągu z guza brzozy miała wpływ na indukcję apoptozy. Komórki HepG2 poddano działaniu ekstraktu z błyskoporka w stężeniu 750 μg/mL przez okres 48 godzin, po czym zbadano zaszłe w nich zmiany morfologiczne za pomocą mikroskopii świetlnej. Hodowla poddana działaniu czagi (Rys. 1B) wykazała wyraźne zmniejszenie ilości komórek w porównaniu z grupą kontrolną.

Czyli płytkę z hodowlą komórek rakowych potraktowano wyciągiem z guza brzozy o różnym stężeniu. Po upływie 48 h okazało się, że 60% komórek rakowych HepG2 i 36% komórek hep3B okazała się nie wykazywać czynności życiowych (nie wykazała metabolizmu). Można było uznać, że są martwe. W tym samym czasie zdrowe komórki wątroby z hodowli porównawczej funkcjonowały bez przeszkód. Następnie sprawdzono, czy brak aktywności biologicznej komórek nowotworowych wynikał z apoptozy, czy z innych przyczyn. Próbki oglądane pod mikroskopem wykazały, że komórki rakowe "zniknęły" w porównaniu z grupą kontrolną. To znaczyło, że podległy samobójczej śmierci, podczas której ulegają one skurczeniu i dezintegracji.

Apoptoza komórek HepG2 pod wpływem wyciągu z czagi

Ponieważ zarówno proces wzrostu komórki, jak i jego zahamowanie podlegają ścisłej regulacji przez system kontroli cyklu komórkowego[16], w następnym etapie zbadaliśmy za pomocą analizy metodą cystometrii przepływowej możliwość hamującego działania wyciągu z guza brzozy na postęp cyklu komórkowego. Wykresy wskazujące rozkład komórek HepG2 po wystawieniu na działanie ekstraktów z guza brzozy o zróżnicowanym stężeniu przedstawia rysunek 2A. 

Wyniki działania ekstraktu z błyskoporka na cykl komórkowy HepG2 podsumowano na rysunku 2B. Jak pokazano na wykresie, wystawienie komórek HepG2 na 48-godzinne działanie wyciągu z guza brzozy o stężeniu 750 μg/mL spowodowało zwiększenie ilości komórek pozostających w fazie cyklu G0/G1 do 75.3% w porównaniu do grupy kontrolnej, w której wyniosło 62.1%. Wymienionemu wzrostowi towarzyszyło jednoczesne zmniejszenie procentowego udziału komórek w fazie cyklu S. Po upływie 48 godz. procent komórek wystawionych na działanie ekstraktu z guza brzozy znajdujących się w fazie S cyklu komórkowego wynosił 2.78%, dla porównania z 9.25% z grupy kontrolnej. Co więcej, analiza cytometrii przepływowej ujawniła wpływ wyciągu z czagi na inicjację procesu apoptozy: wzrost ilości komórek w fazie G0/G1. 

Jak pokazano na rysunku 2C, procent komórek poddanych działaniu wyciągu z guza brzozy znajdujących się w fazie  pod-G0/G1 rósł w sposób zależny od stężenia ekstraktu, dowodząc przebiegu apoptozy. Jednocześnie podczas apoptozy doszło do aktywacji kaspazy w efekcie proteolizy prowadzącej do rozpadu asparaganiny [17]. W związku z powyższym określiliśmy, czy indukcja apoptozy przez wyciąg z guza brzozy spowodowała aktywację kaspazy-3 stanowiącej kluczowy enzym wydzielany podczas samobójczej śmierci komórki (Rys. 2D). Jak pokazano na rysunku 3D, poziom prokaspazy-3 wyraźnie obniżył się w komórkach HepG2 wystawionych na działanie wyciągu z guza brzozy. Powyższe wyniki sugerują, że zahamowanie proliferacji komórkowej oraz indukcja śmierci komórek HepG2 pod wpływem działania wyciągu z błyskoporka mogła zostać spotęgowania przez zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1 i następujący w konsekwencji proces apoptozy, jakiemu towarzyszyła aktywacja kaspazy-3.

Wpływ wyciągu z guza brzozy na regulatory cyklu komórkowego

Supresor antynowotworowy p53 okazał się pełnić ważną rolę w indukcji zahamowania cyklu komórkowego i rozpoczęciu procesu apoptozy.  Kluczową rolę w przejściu cyklu komórkowego z fazy G1 do S okazało się odgrywać białko pRB. Ponieważ mechanizm zahamowania proliferacji komórkowej przez wyciąg z guza brzozy mógł być powodowany ekspresją negatywnych regulatorów cyklu komórkowego, określiliśmy ekspresję białek p53, pRb i p27. Jak pokazano na rys. 4, w zależności od stężenia ekstraktu z guza brzozy ilość białek p53 i pRb w komórkach rakowych HepG2 uległa zdecydowanemu zmniejszeniu (rys. 3). P27, specyficzny inhibitor CDKs, reguluje przede wszystkim proces przejścia cyklu komórkowego z fazy G1 do S. Poziom p27 był również zauważalnie zmniejszony w komórkach poddanych działaniu wyciągu z czagi, w zależności od jego stężenia (rys. 3).

P53 to tzw. supresor antynowotworowy, czyli białko, które chroni organizm przed wystąpieniem nowotworu. Bierze udział w transkrypcji (odczytaniu) DNA i jeśli stwierdzi istnienie uszkodzeń w materiale genetycznym, albo "naprawia" braki, albo uruchamia mechanizm apoptozy. Niestety białko p53 samo może podlegać mutacji. Wówczas najczęściej zamienia się w onkogen, czyli zamiast chronić organizm przed rakiem, samo go wywołuje. Z tego powodu w przypadku wielu nowotworów złośliwych w komórkach stwierdza się podwyższony poziom p53, zazwyczaj zmutowanego. Wyżej cytowane testy wykazały, że w komórkach wystawionych na działanie guza brzozy jego ilość, podobnie jak innych białek regulujących cykl komórkowy i mogących przekształcić się w czynniki przyspieszające rozrost nowotworów, uległa zmniejszeniu.

Zmniejszenie ilości protein regulujących przejście cyklu komórkowego G0/G1

Dla analizy podstawowych mechanizmów biochemicznych biorących udział w regulacji zahamowania przejścia cyklu komórkowego z fazy G0/G1 zbadaliśmy wpływ wyciągu z guza brzozy na poziom białek Cdks i cyklin hamujących postęp cyklu komórkowego G0/G1 Jak pokazano na Rys. 4A, wystawienie komórek HepG2 na 48-godzinne działanie wyciągu z guza brzozy spowodowało zmniejszenie ekspresji Cdk2, Cdk4, i Cdk6 zależne od stężenia ekstraktu. Warto podkreślić, że znacząca redukcja poziomu Cdk2 i Cdk6 była obserwowana już przy zastosowaniu roztworu czagi o stężeniu zaledwie 250 μg/mL. Co więcej, wyciąg z guza brzozy wyraźnie zmniejszył ekspresję cyklin D1, D2, i E (Rys. 4B). Takie wyniki sugerują istnienie ścisłego związku między obniżeniem poziomu cyklin/białek Cdk w komórkach rakowych HepG2 wystawionych na działanie wyciągu z czagi oraz zatrzymaniem postępu cyklu komórkowego G0/G1.

Inaczej pisząc: guz brzozy, już w niewielkich ilościach, zatrzymywał cały cykl komórkowy w obrębie nowotworu. Zmniejszał aktywność związków chemicznych niezbędnych do podziału komórki, a tym samym mocno ograniczał ich zdolność do reprodukcji. Tym samym hamował rozrost nowotworu. 

OMÓWIENIE

Wiele leków przeciwnowotworowych oraz związków wykorzystywanych w leczeniu nowotworów to substancje pochodzenia naturalnego. W niniejszych badaniach potwierdziliśmy, że wodne wyciągi z błyskoporka podkorowego (inonotus obliquus) potęgowały inhibicję ludzkich komórek raka wątroby HepG2, co było ściśle związane z zahamowaniem cyklu komórkowego w fazie G0/G1 oraz inicjacją zjawiska apoptozy.

Cykl komórkowy eukariontów regulowany jest za pośrednictwem komunikatów przekazywanych przez regulatory cyklu komórkowego. Cyliny należą do regulatorów pozytywnych postępu cyklu komórkowego i funkcjonowania komórki, i wchodzą w związek z kinazami cyklinozależnymi CDK. Z kolei inhibitory kinaz cyklino zależnych CDK należą do regulatorów negatywnych cyklu komórkowego i oddziałując na kompleksy cyklina-CDK hamują działanie tych kompleksów [20]. W związku z powyższym indukcja zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy komórek przez leki chemoprewencyjne mogłaby stanowić ważny krok w kierunku leczenie niekontrolowanej proliferacji komórkowej i ograniczenia przeżywalności komórek rakowych.

W ostatnich latach potwierdzono antyzapalne i przeciwnowotworowe właściwości wyciągów z grzybów. Mimo że od lat donoszono o właściwościach antyrakowych, przeciwzapalnych i hepatoochronnych błyskoporka podkorowego, mechanizmy działania guza brzozy na organizm nie zostały jasno wyjaśnione. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że wodny wyciąg z czagi, jaki wykorzystywany był w leczeniu raka i wielu chorób układu pokarmowego, znacząco hamował aktywność biologiczną i namnażanie komórek, jak również indukował apoptozę komórek ludzkiego raka wątroby HepG2 (Rys. 1A), ale nie wywierał wpływu na zachowanie zdrowych, unieśmiertelnionych komórek Chang ludzkiej wątroby (Rys. 1C). Powyższe dane wskazują, że wyciąg z guza brzozy posiada selektywny wpływ cytotoksyczny na komórki ludzkiego raka wątroby. Selektywność ta może mieć ogromne znaczenie dla użycia ekstraktu z błyskoporka na leczenie lub zapobieganie rozwojowi nowotworów. Mimo istnienia wielu doniesień na temat zdolności produktów pochodzenia naturalnego do hamowania cyklu komórkowego na poziomie różnych faz rozwoju komórki, niniejsze badania są pierwszym testem potwierdzającym inhibicyjne właściwości wyciągu z guza brzozy na rozwój hodowli komórek rakowych. W naszych badaniach cystometria przepływowa wyraźnie wykazała, że cykl komórkowy HepG2 był hamowany przez wyciąg z guza brzozy w fazie G0/G1 (Rys. 2A) w sposób zależny od stężenia.

Blokada szlaków kluczowych dla przeżycia komórki lub aktywacja sygnału do apoptozy przez leki antynowtworowe, które w ten sposób zapobiegną proliferacji komórek rakowych, mogą zostać wykorzystane do terapii przeciwnowotworowej. Białko p53 to czynnik transkrypcyjny genów o właściwościach supresora nowotworowego. Jego działanie supresyjne polega na zahamowaniu rozrostu nowotworu przez zatrzymanie cyklu komórkowego i/lub uruchomienie mechanizmu samobójczej śmierci komórek. Mutacje genu p53 występują w więcej niż połowie przypadków nowotworów u ludzi. W związku z powyższym, aktywacja działania białka p53 przez czynniki antynowotworowe może powodować zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozę komórek rakowych, prowadząc do zahamowania rozrostu nowotworu. HepG2 zawiera białko funkcjonalne p53 (wt p53), podczas gdy komórki Hep3B nie posiada funkcjonalnego p53. W naszym badaniu komórki HepG2 okazały się bardziej wrażliwe na niszczące działanie wyciągu z guza brzozy niż komórki Hep3B (rys. 1). W związku z powyższym wysnuliśmy hipotezę, że wt p53 odgrywa ważną rolę w indukcji mechanizmu apoptozy w komórkach HepG2 przez wyciąg z czagi. Tym niemniej nasze wyniki nie pokazują, czy aktywacja p53 może pośredniczyć w cytotoksyczności i zatrzymaniu cyklu komórkowego HepG2 wystawionych na działanie ekstraktu, ponieważ ilość wt p53 uległa obniżeniu przez wyciąg z czagi (rys. 4). Co ciekawe, Park et al (2006)[28] wykazał, że 6-gingerol, główny związek fenolowy zawarty w imbirze, indukował zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1 z jednoczesną ekspresją p21WAF i obniżeniem ekspresji białek p53/pRb w komórkach raka trzustki. W naszym badaniu dotyczącym komórek rakowych HepG2 poddanych działaniu wyciągu z guza brzozy również stwierdzono zmniejszenie poziomu białek pRb, p27 oraz p53. Pytaniem, jakie należy zadać, jest czy zmniejszenie ilości białek p53, pRB i P27 pozostaje ściśle powiązane z ostatecznym różnicowaniem lub innym poziomem szlaków. Niestety na pytanie to w chwili obecnej nie można udzielić odpowiedzi.            

Postęp cyklu komórkowego w przypadku eukariontów obejmuje sekwencyjną aktywację Cdks, których aktywność zależy od powiązania z odpowiadającymi im cyklinami. Zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G1 daje komórce szansę bądź na naprawę, bądź na samobójczą śmierć w wyniku apoptozy [29]. Sugerowano, że u ssaków Cdk kontroluje przejście między fazami G1/S, choć wyniki innych badań zwiększają prawdopodobieństwo, że pełnią również inne, zróżnicowane funkcje. Otrzymane przez nas rezultaty wskazują, że ekspozycja na działanie wyciągu z czagi spowodowała znaczące zmniejszenie ekspresji cyklin D1, D2 i E oraz Cdk2, Cdk4, Cdk6 w komórkach HepG2. Tym samym wysnuliśmy wniosek, że zmniejszenie ekspresji cyklin i Cdk spowodowało zablokowanie formowania kompleksów cyklina/Cdk, i obniżyło poziom pRb (Rys. 3). Gdy białka Rb pozostają niesfosforylowane, E2F pozostają nieaktywne, a komórka nie może przejść do fazy S. Na podstawie uzyskanych danych (Rys. 4) wydaje się, że za proces zatrzymania cyklu komórkowego w odpowiedzi na działanie wyciągu z guza brzozy w większości odpowiadają cykliny D1 i Cdk2 oraz Cdk6, ponieważ ilość tych właśnie regulatorów znacząco spadła już przy najniższych stężeniach wyciągu (250 μg/mL).

Podsumowując, doszliśmy do wniosku, że wyciąg z guza brzozy powodował zahamowanie wzrostu, zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G0/G1 oraz apoptozę komórek ludzkiego raka komórkowego HepG2, lecz nie zdrowych komórek Chang wątroby. Powyższe wyniki mogą dawać nową nadzieję dla rozwoju chemioterapii raka wątroby. Co więcej, lepsze zrozumienie zależności między substancjami chemicznymi pochodzenia naturalnego a genami, krytycznych dla opanowania rozrostu komórek rakowych, dostarczy nowej broni dla skutecznej terapii nowotworów.

Uwagi

Podstawy

Błyskoporek podkorowy (Inonotus obliquus) to rodzaj grzybów z rodziny szczeciniakowatych zaliczanych do gromady grzybów podstawkowych wywołujących białą zgniliznę drewna. Od XVI wieku na terenie Rosji i zachodniej Syberii błyskoporek wykorzystywany był jako ludowy środek leczniczy. Guz brzozy wykazywał zróżnicowaną aktywność biologiczną, w tym posiadał właściwości antybakteryjne, osłaniające wątrobę oraz przeciwnowotworowe. Jednak mimo rosnącego spożycia surowca mechanizmy molekularne jego działania antyrakowego nie zostały dobrze udokumentowane. W związku z powyższym zbadaliśmy przeciwnowotworowe właściwości wyciągu z guza brzozy oraz jego wpływ na mechanizmy molekularne, na które ekstrakt działał hamująco, na przykładzie komórek rakowych wątroby HepG2.

Granice badania

Cykl komórkowy eukariontów regulowany jest za pośrednictwem komunikatów przekazywanych przez regulatory cyklu komórkowego. W związku z powyższym indukcja zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy komórek przez leki chemoprewencyjne mogłaby stanowić ważny krok w kierunku leczenie niekontrolowanej proliferacji komórkowej i ograniczenia przeżywalności komórek rakowych. Mimo istnienia wielu doniesień na temat zdolności produktów pochodzenia naturalnego do hamowania cyklu komórkowego na poziomie różnych faz rozwoju komórki, niniejsze badania są pierwszym testem potwierdzającym inhibicyjne właściwości wyciągu z guza brzozy na rozwój hodowli komórek rakowych.

Odkrycia i przełomy

Wyciąg z guza brzozy posiada selektywny wpłym cytotoksyczny na komórki ludzkiego raka wątroby. Wiele badań dowodziło, że białkowe regulatory cyklu komórkowego takie jak p53 u p27 występują w podwyższonym stężeniu dla zatrzymania cyklu komórkowego w fazie   G0/G1 . Tym niemniej my zaobserwowaliśmy, że wyciąg z guza brzozy zmniejszył ilość p53, pRb i p27 w G0/G1  Dokładne mechanizmy molekularne wpływające na zmniejszenie ilości protein regulujących cykl komórkowy, tj. p53, pRb i p27 pozostają nieznane.

Zastosowanie

Wyciąg z guza brzozy może stanowić alternatywny środek leczniczy jako potencjalny środek przeciwnowotworowy w przypadku leczenia raka wątroby

A jednak jest skuteczny!

Badania, które przetłumaczyłam, miały na celu stwierdzenie, czy błyskoporek podkorowy cechuje się właściwościami przeciwnowotworowymi, jak twierdzi medycyna ludowa, czy może stanowi nieszkodliwe placebo nie wywierające żadnego wpływu na raka? Czy jest sens zażywania guza brzozy, czy może sprzedający go to hochsztaplerzy zbijający fortunę na beznadziejnie chorych ludziach? Czy doniesienia o wyleczonych/zaleczonych nowotworach to wytwór wyobraźni i sposób na reklamę bezużytecznego specyfiku, czy może tkwi w nich ziarno prawdy? I oto w laboratorium potwierdzono, że substancje zawarte w wyciągu z guza brzozy potrafią oddziaływać na zachowanie komórki. I to w sposób kluczowy dla rozwoju medycyny, bowiem robią to na poziomie molekularnym, zmuszając nowotwór do samobójczej śmierci.

Podczas badań posługiwano się jedynie dwoma rodzajami komórek rakowych jednego narządu, badając jednocześnie wpływ guza brzozy na zdrową wątrobę. Potwierdzono, że  nie wszystkie rodzaje nowotworów okazują się wrażliwe na czagę. Podczas gdy jedne praktycznie zanikają bo redukcja aktywności biologicznej komórek o 60-70% to olbrzymi postęp na drodze do skutecznego zaleczenia choroby, to inne niestety umierają dużo wolniej. Wydaje się jednak, że z perspektywy osoby chorej już samo zahamowanie rozrostu nowotworu (i jego redukcja o choćby 30%) daje więcej nadziei, niż bazowanie wyłącznie na konwencjonalnych środkach leczniczych. Co więcej - testy udowodniły, że wyciąg guza brzozy ma działanie wybiórcze i niezależnie od stężenia nie atakuje ani nie uszkadza zdrowych komórek wątroby. Czyli chorym pomaga, a zdrowym nie szkodzi, nawet w wysokich dawkach.

I jeszcze na koniec - bardzo ważna jest konkluzja biologów, że błyskoroporek nie pozwala komórkom przejść z fazy G0 do fazy G1. Oznacza to, że potrafi działać prewencyjnie i zmuszać do śmierci (aktywować apoptozę) komórek starych, z wadliwym materiałem genetycznym, którym włącza się "nieśmiertelność" i które mogłyby, z dużym prawdopodobieństwem, zacząć namnażać się jako nowotwór. Słowem - wypicie raz czy dwa razy w tygodniu odwaru z guza brzozy może chronić organizm przed wystąpieniem niektórych nowotworów. Na pewno zaś nie zaszkodzi.